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抗肿瘤新药——重组vasostatin-Apo2L融合蛋白
上海恰尔生物技术有限公司从2003年下半年开始，对人内源性新生血
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| 管抑制因子——人钙网蛋白（即vasostatin）开展了研究，已经通过常 |
| 规RT-PCR扩增出vasostatin的基因，并已克隆入工作载体，同时将另一 |
| 种人自身肿瘤凋亡诱导因子——人凋亡素2配体或称肿瘤坏死因子相关凋 |
| 亡诱导配体（即Apo2L/TRAIL）和vasostatin编码序列通过氨基酸连接臂 |
| 进行连接。我们已完成vasostatin-Apo2L融合蛋白的表达，确认序列的 |
| 正确性；初步完成理论分析序列的差异对活性的可能影响；体外细胞毒试 |
| 验显示对不同类型的细胞具有选择性杀伤作用，其中对肿瘤细胞的直接细 |
| 胞毒效果明显强于正常细胞；初步的作用机制研究表明，该重组表达的融 |
| 合蛋白既具有特异抑制内皮细胞的增殖、诱导其凋亡的作用，又具有特异 |
| 的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。 |
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| 我们研究的TRAIL和Vasostatin基因来源和获得方法均与国内外不同 |
| ，应用了与国内外完全不同的方法克隆、重组表达，并且将TRAIL和 |
| Vasostatin进行融合表达，作为抗肿瘤新药进行临床前研究，我公司属 |
| 首创，并对Vasostatin-Apo2L融合蛋白的发明专利进行了保护。该发明 |
| 已经获得第二十届上海市优秀发明选拔赛发明产品推广实施金奖。 |
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| 目前我们正在开展的工作是建立融合蛋白的中试工艺，包括大容积发 |
| 酵、批量制备，测活条件的稳定与优化；建立融合蛋白质量标准草案；建 |
| 立移植瘤动物模型，观察重组表达的纯化后融合蛋白的抗肿瘤效应（药效 |
| 学研究）以及进行融合蛋白的药学研究、毒理学研究、药代动力学研究等 |
| 一系列临床前的研究。 |
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| 在体外细胞毒试验中，我们观察了融合蛋白对30多株不同来源的肿瘤 |
| 细胞和正常细胞的直接细胞毒作用。实验结果显示对不同类型的细胞具有 |
| 选择性作用，用低剂量浓度的融合蛋白即可诱导10株细胞如人胰腺导管癌 |
| 上皮细胞1990、人肝癌细胞SMMU7721、人肝癌细胞HepG-2、人肺癌细胞 |
| A549、鼠源性肉瘤细胞S180、人内皮细胞ECV304、人黑色素瘤细胞B16- |
| MB、人结肠癌细胞HCT-8、人大细胞肺癌NCI-H460、人鼻咽癌CNE-2、人 |
| 喉癌Hep-2、人结肠癌AT-29、人肺癌Lewis、人星形胶质瘤U251、人卵巢 |
| 癌3AO、人乳腺癌MCF-7、人髓性恶性细胞如Jurkat、K562、U937、6T- |
| CEM等细胞的调亡；对于其他的肿瘤细胞，如人胰腺导管癌上皮细胞 |
| 8898、鼠成纤维细胞L929、人神经母细胞瘤SK-N-SH、人宫颈癌HeLa、人 |
| 白血病HL60、人羊膜细胞Wish、鼠肾细胞COS-7等细胞需要相对高浓度剂 |
| 量的融合蛋白才能诱导其调亡；对于培养的正常细胞，如人肝脏培养细胞 |
| L-O2，人胚肾293细胞(Ad5转化)则需要在更高浓度剂量的融合蛋白才具 |
| 有细胞毒作用。融合蛋白在体外细胞毒试验显示对不同类型的细胞具有选 |
| 择性作用，其中对肿瘤细胞的直接细胞毒效果明显强于正常细胞，初步显 |
| 示融合蛋白对肿瘤细胞的直接细胞毒效果明显强于正常细胞，初步验证了 |
| 融合蛋白的体外抗肿瘤活性。 |
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| 我们开展了对融合蛋白的初步药效学和毒理学的研究： |
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| 初步的体内药效学显示：体内抗肿瘤试验高、中、低三个剂量组，对 |
| 人体肿瘤异种移植于免疫缺陷裸小鼠的肝癌SMMU7721的三次试验抑瘤率高 |
| 、中、低三个剂量组分别为 54.38%、42.48%、30.07%，51.18%、 |
| 40.14%、31.39%，52.10%、43.12%、31.85%； |
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| 对人体肿瘤异种移植于免疫缺陷裸小鼠肠癌HCT-8相同给药方案三次 |
| 结果分别为63.58%、49.48%、31.49%，64.19%、52.58%、36.13%， |
| 61.03%、53.09%、36.99%； |
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| 对人体肿瘤异种移植于免疫缺陷裸小鼠胰腺导管癌SW1990相同给药 |
| 方案三次结果分别为44.37%、34.57%、27.15%，47.20%、35.12%、 |
| 29.17%，45.15%、33.33%、29.24%； |
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| 对静脉接种的B16黑色素瘤其抗实验肺转移的效果，相同给药方案三 |
| 次结果分别为51.38%、43.44%、31.73%，53.90%、43.89%、29.29%， |
| 52.06%、45.02%、33.09%。 |
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| 实验抗肿瘤研究显示融合蛋白对多种人体肿瘤异种移植于免疫缺陷裸 |
| 小鼠模型及对B16黑色素瘤实验性肺转移模型均具有中等度以上的疗效。 |
| 结果显示原核表达的融合蛋白无论是体外或体内试验均能显示较明显的抗 |
| 肿瘤、抗转移效果，实验具有重现性。所有实验中动物给药前后体重有明 |
| 显地上升，与阴性对照组接近，提示在使用治疗剂量时本品的毒性较小。 |
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| 初步的毒理学研究表明，在清洁级SD大鼠、ICR小鼠尾静脉(iv)或腹 |
| 腔注射(ip)给予最高浓度、最大给药量的融合蛋白，连续观察10天未出现 |
| 任何异常反应，也未引起死亡；结果显示：大鼠iv、ip的最大耐受量均 |
| >180mg/kg；小鼠iv、ip的最大耐受量均 >300mg/kg。按药物常规溶血 |
| 试验方法，结果显示融合蛋白无溶血作用。 |
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| 本课题组的前期工作已初步证实了Vasostatin-TRAIL融合蛋白在体 |
| 内外具有直接的杀伤肿瘤和抑制新生血管的双重功能。本研究所得到的融 |
| 合蛋白质可以在两者的协同下增强抗肿瘤的效果，还可减少两者分别给药 |
| 给患者所带来的麻烦和痛苦，为抗肿瘤等疾病的治疗提供新的药物。 |